Thời Trịnh Tráng, xung đột Trịnh-Nguyễn chính thức bùng phát. Từ năm 1625, chúa Nguyễn Phúc Nguyên không còn nộp thuế cho chính quyền Lê-Trịnh, lại theo kế của Đào Duy Từ, đắp luỹ ở bờ nam cửa bể Nhật Lệ để tự thủ.[1] Năm 1627, chúa sai Nguyễn Hữu Bản đến Thuận Hóa đòi tô thuế từ năm Giáp Tí (1624) về trước. Chúa Nguyễn không chịu nộp thuế. Đến tháng 2 ÂL, Trịnh Tráng muốn vào đánh Thuận Hóa nhưng chưa có cớ gì, bèn sai Lê Đại Dụng phụng sắc mệnh nhà vua dụ bảo về việc cho con vào chầu, và đòi nộp 30 thớt voi, 30 chiếc thuyền đi biển, để cho đủ thể lệ cống nạp nhà Minh. Chúa Nguyễn lại thoái thác. Trịnh Tráng bèn hạ lệnh cho Nguyễn Khải, Nguyễn Danh Thế làm tiên phong đem 5000 quân đóng ở Hà Trung[8]. Tráng tự thân đem đại binh kế tiếp xuất phát; lại mang nhà vua cùng đi, lấy cớ tuần du các địa phương; quân thủy, quân bộ tổng cộng hơn 200.000 cùng nhau đều tiến[3]. Chúa Nguyễn sai Tôn Thất Vệ, Nguyễn Hữu Dật, Nguyễn Phúc Trung cùng nhau chống giữ ở bờ bắc sông Nhật Lệ. Quân Trịnh chủ động tấn công nhưng không chọc thủng được tuyến phòng thủ của quân Nguyễn. Phía Nguyễn có lợi thế là đại bác kiểu Bồ Đào Nha nên làm quân Trịnh sợ chạy dạt. Trong lúc hai bên tiếp tục giằng co thì Nguyễn Hữu Dật phao tin ở miền bắc, Trịnh Gia và Trịnh Nhạc âm mưu làm phản. Trịnh Tráng nghi ngờ vội thu quân về bắc.

Năm 1633, con thứ ba của Chúa Nguyễn là Phúc Anh bất mãn không được làm thế tử, bèn viết thư hẹn làm nội ứng cho Trịnh Tráng. Trịnh Tráng khởi binh nam tiến lần thứ hai, đóng ở cửa Nhật Lệ. Chúa Nguyễn cử Nguyễn Hữu Dật, Nguyễn Hữu Tiến làm tướng ra đánh. Trịnh Tráng đang đợi suốt hơn 10 hôm không thấy hiệu làm nội ứng của Ánh thì bị quân Nguyễn đánh úp, quân Trịnh hoảng loạn tan vỡ bỏ chạy. Trịnh Tráng rút về bắc, để lại con rể là Nguyễn Khắc Liệt trấn thủ châu Bắc Bố Chính[3][9].

Năm 1635, chúa Nguyễn Phúc Nguyên mất, con là Nguyễn Phúc Lan lên nối ngôi. Năm 1637, Phúc Lan sai Nguyễn Đình Hùng mang quân đánh úp chiếm Nam Bố Chính, giết tướng trấn thủ là Nguyễn Tịch. Năm 1640, Nguyễn Khắc Liệt mang quân đánh phá Nam Bố Chính rồi rút về[10]. Chúa Nguyễn theo kế của Nguyễn Hữu Dật, viết thư cho Trịnh Tráng nói Liệt mưu thông đồng với chúa Nguyễn nên mặt ngoài gây chiến mà bên trong muốn hàng. Mặt khác, Nguyễn Phúc Lan thúc quân đánh Khắc Liệt. Khắc Liệt thua chạy, viết thư cầu cứu. Tin lời bên Nguyễn, Trịnh Tráng điều Trịnh Kiều mang quân vào bắt Liệt về xử tử. Quân Nguyễn nhân thời cơ đánh chiếm Bắc Bố Chính.

Về sự việc này, theo sách Đại Nam thực lục của nhà Nguyễn, Khắc Liệt đã thông đồng với bên Nguyễn từ năm 1634, nhưng vài năm sau vẫn nấn ná chưa về hàng, lại có ý "làm cao" nên chủ động đánh vào đất Nguyễn để uy hiếp. Chúa Nguyễn sợ Liệt thay đổi ý định nên viết thư cho chúa Trịnh báo việc này.

Năm 1643, Trịnh Tráng sai bọn Trịnh Tạc và Trịnh Lệ làm tiên phong cùng Phạm Công Trứ, Nguyễn Danh Thọ kéo quân đánh Nam Bố Chính. Viên trấn thủ của chúa Nguyễn là Bùi Công Thắng tử trận. Nhân đó, ông đích thân thống suất đại quân, mang theo cả nhà vua đến châu Bắc Bố Chính, đóng tại An Bài, sai Trịnh Đảo đánh vào doanh lũy Trung Hòa. Quân Nguyễn ra sức chống cự. Lúc đó sắp vào hè, thời tiết nóng nực nên Trịnh Tráng phải rút quân về[3][10]. Cử Lê Văn Hiểu, Lê Hữu Đức đóng giữ ở Hòa Trung, quận Mậu Phạm Tất Toàn giữ Bắc Bố Chính.

Năm 1648, Trịnh Tráng sai quận Tiến Lê Văn Hiểu khởi binh nam tiến lần thứ tư, dẫn bộ binh đánh Nam Bố Chính, còn thuỷ quân đánh cửa Nhật Lệ. Quân Trịnh vượt qua lũy Nhật Lệ, áp sát lũy Trường Dục[11], dùng đại bác bắn vỡ nhiều đoạn. Hai cha con tướng Nguyễn Trương Phúc Phấn cố thủ ở lũy Trường Dục, lại nhân đó tìm cách vá lũy, quân Trịnh đánh không hạ được. Thế tử Nguyễn Phúc Tần tiến quân đến xã An Đại, hội các tướng bàn rằng:

Quân họ Trịnh tuy nhiều nhưng người đánh giỏi có ít. Nếu ta nhân lúc ban đêm dùng voi xông vào, tất nhiên bên kia mất hết khí phách mà bỏ chạy tan vỡ, bấy giờ ta đem đại binh tiến đánh, thì đánh một trận cũng có thể bắt được.

Bèn sai phục quân ở sông Cẩm La chặn đường quân Trịnh chạy về; một mặt sai Nguyễn Hữu Tiến đem 100 con voi đến canh năm xông vào trại quân Trịnh, quân bộ tiếp sau vào đánh phá. Quả nhiên quân Trịnh thua to chạy về Bắc, lại gặp quân thủy của họ Nguyễn đón đường đuổi đánh mãi đến sông Lam Giang mới thôi. Quân Trịnh thua, thiệt hại 3000 người. Trịnh Tráng lui binh, sai Lê Văn Hiểu giữ Hà Trung, Lê Hữu Đức đóng ở Hoành Sơn[12], Phạm Tất Toàn giữ Bắc Bố Chính[6][10].

Tháng 2 ÂL năm 1655, chúa Trịnh cử Lê Văn Hiểu đưa quân vào xâm lấn Nam Bố Chính. Chúa Nguyễn Phúc Tần hạ lệnh cho bọn Nguyễn Hữu Tiến, Nguyễn Hữu Dật chặn đánh ở sông Gianh[13], phá tan được quân Trịnh, tướng Phạm Tất Toàn đem châu Bố Chính đầu hàng. Quân Nguyễn kéo đến Hoành Sơn, rồi đánh Hà Trung. Lê Văn Hiểu cùng bọn Hữu Đức chạy về An Trường; sau đó tiến quân đóng ở Đại Nại, chia quân ra chống cự phòng thủ.

Tháng 6 ÂL, chúa Trịnh triệu hồi Lê Văn Hiểu, Lê Hữu Đức, sai Trịnh Trượng giữ chức thống lĩnh, cùng Nguyễn Văn Trạc, Nguyễn Tính đốc suất binh kinh lý Nghệ An. Quân Nguyễn lui về phía bắc sông Gianh, Trịnh Trượng đóng quân ở Lạc Xuyên. Khi Nguyễn Hữu Tiến đem quân tới đánh, quân Trịnh bị thua; còn Nguyễn Hữu Dật thì đem thủy binh ra đánh cửa Kỳ La, đuổi chiến thuyền của họ Trịnh về cửa Châu Nhai; thừa thắng đánh vào Lạc Xuyên, quân Trịnh lui về An Trường. Thế là bảy huyện phía nam sông Lam Giang đều rơi cả vào tay họ Nguyễn[6][10].

Tháng 9 ÂL, Trịnh Tráng sai Trịnh Tạc làm Thống lĩnh, đến Nghệ An chỉ huy các đạo quân ở đó. Được ít lâu, vì trong nước xảy ra nhiều việc, chúa cho triệu Trịnh Tạc về, để Đào Quang Nhiêu ở lại giữ Nghệ An, thống lãnh các tướng đóng ở An Trường, cùng các tướng khác chia nhau phòng giữ. Sang năm 1656, quân Nguyễn đánh đồn Tiếp Vũ, tướng Trịnh bỏ chạy. Các đạo quân Nguyễn thừa thế truy kích, Đào Quang Nhiêu bại trận phải lui về giữ An Trường. Trịnh Tráng theo lời tiến cử, sai con út là Ninh quận công Trịnh Toàn ra thay thế[10]. Mùa hạ tháng 5 ÂL, quân Nguyễn của Dương Trí đánh bại được quân họ Trịnh ở cửa biển Nam Giới. Trịnh Toàn dẫn quân đánh nhau với Tống Phúc Khang ở Đại Nại, nhưng bị viện quân của Nguyễn Hữu Tiến đánh bại, chạy thẳng về An Trường.

Ngày 28 tháng 5 năm 1657, Trịnh Tráng mất giữa lúc cuộc chiến Trịnh-Nguyễn vào thời kì khốc liệt nhất, thọ 81 tuổi, cầm quyền 34 năm (1623 - 1657). Ông được truy tặng là Văn Tổ Nghị vương, thụy là Long Tự. Trịnh Tạc lên nối ngôi[4][6]. Ba năm sau (1660), cháu nội ông là Trịnh Căn mới đẩy lùi được quân Nguyễn trở về nam sông Gianh.